金黄色葡萄球菌(SA)\沙门氏菌（SAL)\单增李斯特菌(LM)三重核酸检测试剂盒

【所需仪器及耗材】

①荧光定量 PCR 仪；②PCR 管、移液枪及配套吸头；③涡旋振荡器；④迷你离心机

【检测方法】

1. 样品处理

1.1 样本类型：适用于疑似金黄色葡萄球菌或沙门氏菌或单增李斯特菌污染的食品、饲料、环境及水体等样品，对 于深加工肉制品、饮料等含有色素类物质时，需要对其进行漂洗处理，以免影响荧光信号采集。

1.2  采样：

(1) 食品（含原料）、饲料、化妆品等样本：选取同一批次产品或原料，随机采取至少 5 个样本，各样本采集 10 g (mL)，然后将采集的样本混匀。如为鸡蛋，则将采集的鸡蛋样本（至少 5 个）打碎至无菌烧杯中混匀。(2)环境（含鸡蛋表面）：用沾有生理盐水的拭子，于各环境表面（包括鸡蛋表面）来回擦拭，各采样表面用 1 个拭 子，然后放入采集管中。为检测同一环境中的致病菌情况，同一个环境内可多处取样，取样拭子放入同一采集管 中，旋涡振荡混匀 2 min，进行混检。(3) 水体：各水源处取样 10 mL，混匀水样，8000-10000 rpm 离心 2 min， 倒去上清液，取底部溶液 200L 直接进行核酸提取混匀。

1.3 增菌培养或检测：

(1) 食品（含原料）、饲料、化妆品等样本：A.亲水性样品（包括鸡蛋）：称取 2.5 g (mL)加入到已灭菌的 22.5 mL 增菌液离心管（或三角瓶）中；B.疏水性样品：移取 1.25 g (mL)加 1.25mL 经灭菌的吐温 80，再加入到 已灭菌的 22.5 mL 增菌液离心管（或三角瓶）中。(2) 环境样本：用移液枪吸取经振荡混匀的采集液 2.5 mL 加入 到已灭菌的 22.5 mL 增菌液离心管（或三角瓶）中。

(2) 将已添加上述样本的增菌液离心管（或三角瓶）摇匀后，于 36±1℃、100-150 转/分钟的条件下，恒温 培养 18-24 h，即得增菌培养液，可用于后继各致病菌的检测。

1.4 或按照 GB4789.4-2016 进行采样和增菌处理。

2. 核酸提取

采用市售或本公司开发的磁珠法或柱离心法进行核酸提取：按照试剂盒具体操作说明进行核酸提取。

3. 核酸扩增

3.1 打开荧光定量 PCR 仪，待用。准备冻干试剂、复溶液、待检核酸样本、阳性对照、阴性对照。

3.2 配制如下反应体系：

试剂                                                       25μL 反应体系

复溶液                                                           20 μL

待检核酸样本/阳性对照/阴性对照                    5 μL

     撕开铝箔袋包装的冻干检测试剂，根据所需的检测数量准备好相应的 PCR 反应管，按照反应体系将复溶液和 相应模板添加到冻干试剂里，待检样本和阴阳性对照各设置一孔，涡旋振荡混匀，瞬时离心，将溶液收集到管底。 3.3 将 PCR 反应管转移至荧光 PCR 仪，反应体系选择 25L，在每个循环的 58℃采集荧光信号，检测通道选择 ROX、 FAM、CY5。

【结果判定】

在阴性对照反应管荧光值水平不起峰或 CT 值大于 36，阳性对照反应管 CT 值小于 36 且荧光曲线为“S”曲线的 前提下：

(1) 待检样品反应管荧光值水平不起峰，或者起峰 Ct 值大于 36，该样品检测结果判为阴性；

(2) 待检样品反应管荧光值起峰，33≤Ct 值≤36，该样本检测结果判为疑似阳性，建议重新采样或重新提取核 酸进行检测，扩增后进行结果判定，如仍是可疑，可判定为阳性。

(3) 待检样品反应管荧光值为“S”曲线，且起峰 Ct 值小于 33，该样品检测结果判为阳性；

(4) 若阴阳性对照反应管结果与上述情况不符，则本次检测结果无效，应重新检测或与本公司联系。

【浓度计算】

如无増菌培养过程，且需计算致病菌浓度的，可通过下面公式计算浓度（注：CT 为荧光 PCR 检测结束后的 CT 值）：

【注意事项】

(1)使用本试剂盒前请仔细阅读说明书。由于操作不当引起的误判，以及由此误判引发的其他事项，本公司概 不负责。(2)本试剂检测灵敏度高，为防止污染，实验应严格物理性间隔分区操作。试剂配置区用于配置所需要的 所有试剂；样品前处理区用于待测样品的核酸提取和模板的加入，建议配备超净工作台；扩增观察区用于反应进 行和结果判读。各区内空间独立，试验用品专用，避免交叉污染。(3)检测过程中建议穿洁净工作服，带一次性手 套，使用的枪头需提前灭菌。(4)不同批次的产品请勿混合使用，在有效期内使用。(5)阳性对照可能会作为污染 源，污染其他试剂和待检样品，导致出现假阳性结果，在加样过程中建议最后加入阳性对照。(6)上机前注意检查 PCR 反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器。(7) 反应结束后 PCR 扩增管应置于密封袋内立马丢弃，禁止 开盖，以防止出现气溶胶污染。不得重复使用。使用完毕废弃时按照医疗废弃物相关规定处理，由使用者自行负 责处理。(8) 本试剂盒仅用于单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的检测。(9) 工作台及各物品定期用 1% 次氯酸钠、75%酒精或紫外灯处理。