肠炎沙门氏菌（SE）核酸检测试剂盒

【所需仪器及耗材】

①荧光定量 PCR 仪；②移液枪及配套吸头；③涡旋振荡器；④迷你离心机

【检测方法】

1. 样品处理

1.1 样本类型：拭子、组织、粪便等。

1.2 采样：所有样本采集完后需要及时检测，否则需要冻存于-20 或-80℃条件下长期保存。

①活禽：采用拭子于鼻腔、肛门、泄殖腔等部位采样，轻轻翻转涂抹，沾泄殖腔分泌物，完成采集后将拭子 放入含 0.5mL 生理盐水或核酸保存液的采集管中。

②病死禽：采集病死禽的卵巢、脾脏、肝脏以及小肠和盲肠，取组织或粪便  1g，加生理盐水  5mL，充分研 磨，得到匀浆液。组织样本采样建议进行 5 点采样法。

③环境：对鸡舍或环境，采用粘湿有生理盐水的拭子于鸡笼、墙壁表面擦拭采样，每处用 1 个拭子，完成采 集后将拭子放入含 0.5mL 生理盐水或核酸保存液的采集管中，同一鸡舍多处采样，所有采样拭子均放入同一采集 管中进行混检。

注：拭子样本如需做混检，当感染率较高时建议做 5 合 1 混采，即 5 个拭子样本混合在含有 2.5mL 生理盐水或核酸保存液中，感染率中等时建议做 10 合 1 混采，即 10 个拭子样本混合在含有 5mL 生理盐水或核酸保存液中；感染率较低时建议做 20 合 1 混采，即 20 个拭子样本混合在含有 10mL 生理盐水或核酸保存液中。

2. 核酸提取

     采用市售或本公司开发的磁珠法或柱离心法进行核酸提取：按照试剂盒具体操作说明进行核酸提取。

3. 核酸扩增

3.1 打开荧光定量 PCR 仪，待用。准备冻干试剂、复溶液、阳性对照、阴性对照、待检核酸样本。

3.2 配制如下反应体系：

     试剂                                                          25μL 反应体系

   复溶液                                                                 20 μL

待检核酸样本/阳性对照/阴性对照                               5 μL

撕开铝箔袋包装的冻干检测试剂，根据所需的检测数量准备好相应的  PCR     反应管，按照反应体系将复溶液和 相应模板添加到冻干试剂里，待检样本和阴阳性对照各设置一孔，涡旋振荡混匀，瞬时离心，将溶液收集到管底。

3.3 将 PCR 反应管转移至荧光 PCR 仪，反应体系选择 25 μL，在每个循环的 55℃采集荧光信号，检测通道选择 FAM。

【结果判定】

在阴性对照反应管荧光值水平不起峰或 CT 值大于 36，阳性对照反应管 CT 值小于 36 且荧光曲线为“S”曲线的 前提下：

     (1) 待检样品反应管荧光值水平不起峰，或者起峰 Ct 值大于 36，该样品检测结果判为阴性；

(2) 待检样品反应管荧光值起峰，33≤Ct 值≤36，该样本检测结果判为疑似阳性，建议重新采样或重新提取核酸 进行检测，扩增后进行结果判定，如仍是可疑，可判定为阳性。

      (3) 待检样品反应管荧光值为“S”曲线，且起峰 Ct 值小于 33，该样品检测结果判为阳性；

      (4) 若阴阳性对照反应管结果与上述情况不符，则本次检测结果无效，应重新检测或与本公司联系。

【注意事项】

(1) 使用本试剂盒前请仔细阅读说明书。由于操作不当引起的误判，以及由此误判引发的其他事项，本公司 概不负责。

(2) 本试剂检测灵敏度高，为防止污染，实验应严格物理性间隔分区操作。试剂配置区用于配置所需要的所 有试剂；样品前处理区用于待测样品的核酸提取和模板的加入，建议配备超净工作台；扩增观察区用于反应进行 和结果判读。各区内空间独立，试验用品专用，避免交叉污染。

      (3) 检测过程中建议穿洁净工作服，带一次性手套，使用的枪头需提前灭菌。

      (4) 不同批次的产品请勿混合使用，在有效期内使用。

(5) 阳性对照可能会作为污染源，污染其他试剂和待检样品，导致出现假阳性结果，在加样过程中建议最后 加入阳性对照。

      (6) 上机前注意检查 PCR 反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器。

(7) 反应结束后 PCR 扩增管应置于密封袋内立马丢弃，禁止开盖，以防止出现气溶胶污染。不得重复使用。 使用完毕废弃时按照医疗废弃物相关规定处理，由使用者自行负责处理。

       (8) 本试剂盒仅用于肠炎沙门氏菌（SE）的检测。

       (9) 工作台及各物品定期用 1%次氯酸钠、75%酒精或紫外灯处理。