单增李斯特氏菌（LM）核酸检测试剂盒

【所需仪器及耗材】

①荧光定量 PCR 仪；②移液枪及配套吸头；③涡旋振荡器；④迷你离心机

【检测方法】

1. 样品处理

1.1 样本类型：本试剂盒适用于疑似单增李斯特氏菌污染的食品、饲料、环境及水体等样品，对于深加工肉制品、 饮料等含有色素类物质时，需要对其进行漂洗处理，以免影响荧光信号采集。

1.2 采样：所有样本采集完后需要及时检测，否则需要冻存于-20 或-80℃条件下长期保存。

(1) 食品（含原料）、饲料、化妆品等样本：选取同一批次产品或原料，随机采取至少 5 个样本，各样本采集10 g (mL)，然后将采集的样本混匀。如为鸡蛋，则将采集的鸡蛋样本（至少 5 个）打碎至无菌烧杯中混匀。

(2) 环境（含鸡蛋表面）：用沾有生理盐水的拭子，于各环境表面（包括鸡蛋表面）来回擦拭，各采样表面用  1     个拭子， 然后放入采集管中。为检测同一环境中的致病菌情况，同一个环境内可多处取样，取样拭子放入同一采集管中， 旋涡振荡混匀 2 min，进行混检。(3) 水体：各水源处取样 10 mL，混匀水样，8000-10000 rpm 离心 2 min，倒去 上清液，取底部溶液 200L 直接进行核酸提取混匀。

1.3 增菌培养：

(1) 食品（含原料）、饲料、化妆品等样本：A.亲水性样品（包括鸡蛋）：称取 2.5 g (mL)加入到已灭菌的 22.5 mL 增菌液离心管（或三角瓶）中；B.疏水性样品：移取 1.25 g (mL)加 1.25mL 经灭菌的吐温 80，再加入到已灭 菌的 22.5 mL 增菌液离心管（或三角瓶）中。(2) 环境样本：用移液枪吸取经振荡混匀的采集液 2.5 mL 加入到已 灭菌的 22.5 mL 增菌液离心管（或三角瓶）中。

      将已添加上述样本的增菌液离心管（或三角瓶）摇匀后，于 36±1℃、100-150 转/分钟的条件下，恒温培养 18-24 h，即得增菌培养液，可用于后继各致病菌的检测。

2. 核酸提取

采用市售或本公司开发的磁珠法或柱离心法进行核酸提取：按照试剂盒具体操作说明进行核酸提取。

3. 核酸扩增

3.1 打开荧光定量 PCR 仪，待用。准备冻干试剂、复溶液、阳性对照、阴性对照、待检核酸样本。

3.2 配制反应体系：

                试剂                                          25μL 反应体系

              复溶液                                                        20 μL

待检核酸样本/阳性对照/阴性对照                               5 μL

      撕开铝箔袋包装的冻干检测试剂，根据所需的检测数量准备好相应的 PCR 反应管，按照反应体系将复溶液和 相应模板添加到冻干试剂里，待检样本和阴阳性对照各设置一孔，涡旋振荡混匀，瞬时离心，将溶液收集到管底。 3.3 将 PCR 反应管转移至荧光 PCR 仪，反应体系选择 25L，在每个循环的 58℃采集荧光信号，检测通道选择 FAM。

【结果判定】

在阴性对照反应管荧光值水平不起峰或 CT 值大于 36，阳性对照反应管 CT 值小于 36 且荧光曲线为“S”曲线的 前提下：

(1) 待检样品反应管荧光值水平不起峰，或者起峰 Ct 值大于 36，该样品检测结果判为阴性；

(2) 待检样品反应管荧光值起峰，33≤Ct 值≤36，该样本检测结果判为疑似阳性，建议重新采样或重新提取核 酸进行检测，扩增后进行结果判定，如仍是可疑，可判定为阳性。

(3) 待检样品反应管荧光值为“S”曲线，且起峰 Ct 值小于 33，该样品检测结果判为阳性；

(4) 若阴阳性对照反应管结果与上述情况不符，则本次检测结果无效，应重新检测或与本公司联系。

【计算公式】

如无增菌培养过程，且需计算该致病菌浓度的，可通过下面公式计算浓度：